Tradutores: Paulo Nadanovsky, Rachel Riera
Kile Green1, Amanda Winter2, Rachel Dickinson2, Sara Graziadio2, Robert Wolff3, Susan Mallett4, A. Joy Allen1
1NIHR Newcastle In Vitro Diagnostics Co-operative
Universidade de Newcastle, Newcastle upon Tyne, NE2 4HH
2NIHR Newcastle In Vitro Diagnostics Co-operative
Newcastle upon Tyne NHS Hospitals Foundation Trust, Newcastle upon Tyne, NE1 4LP
3Kleijnen Systematic Reviews Ltd
Unit 6, Escrick Business Park, York, YO19 6FD
4Instituto de Pesquisa Aplicada à Saúde
Universidade de Birmingham B15 2TT
PARECER
Muitos testes diagnósticos para a doença do coronavírus 2019 (COVID-19) estão disponíveis até o momento, com mais testes recebendo aprovação emergencial a cada dia. Os testes são baseados em quatro técnicas diferentes: (1) reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (RT-PCR) – o teste padrão atual para COVID-19; (2) amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) – um método de testagem simples, mas menos desenvolvido; (3) fluxo lateral – teste portátil de uso único que fornece resultado em até 15 minutos; e (4) ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) – teste rápido e tecnicamente simples, de fácil leitura e rendimento relativamente alto.
CONTEXTO
Uma série de técnicas moleculares incluindo testagem em laboratório central ou no próprio local de atendimento (point-of-care) estão em desenvolvimento ou já disponíveis para o diagnóstico e manejo de pacientes com COVID-19. Estas técnicas, embora conhecidas por pesquisadores e clínicos com formação em amplificação de ácido desoxirribonucleico (DNA), bem como em ensaios de anticorpos e antígenos, podem ser relativamente desconhecidas para a comunidade em geral. Este documento foi escrito para resumir e explicar os princípios básicos dos principais testes diagnósticos da COVID-19 atualmente em uso ou em fase de pesquisa.
GLOSSÁRIO
Os termos-chave utilizados neste documento (destacados em negrito) são descritos aqui:
Anticorpos – Anticorpos são proteínas protetoras produzidas naturalmente em resposta à notificação da presença de estruturas estranhas (antígenos), por exemplo, durante uma infecção viral. O corpo produz anticorpos precoces ‘protótipos’ (IgM) com força intermediária para se ligarem ao vírus. Eles são capazes de começar a trabalhar para eliminar o vírus cerca de cinco dias após o início da infecção. Normalmente, oito a dez dias após o início da infecção, os anticorpos IgG, que possuem alta força de ligação ao vírus, podem funcionar para ajudar na eliminação mais rápida do vírus. Os anticorpos atuam desenvolvendo uma superfície de contorno compatível para aderir aos antígenos, usando um sofisticado processo de seleção que amplifica aqueles anticorpos com melhor compatibilidade de superfície e maior força de ligação.
Antígeno – Um antígeno é uma estrutura reconhecida como estranha pelo corpo humano que aciona o sistema imunológico para produzir sistemas de autodefesa e eliminar patógenos do sangue e tecidos. A eliminação de antígenos é liderada por anticorpos e glóbulos brancos.
COVID-19 – Doença do coronavírus-19 – Uma doença respiratória causada pelo coronavírus 2 da síndrome respiratória aguda grave (SARS-CoV-2), coloquialmente referido como coronavírus. A família dos coronavírus inclui não apenas o SARS (-1 e -2) e MERS, mas também formas mais brandas(causadoras de 15-20% dos resfriados comuns).
DNA – Ácido desoxirribonucleico – A molécula que o ser humano, e a maioria dos organismos, utiliza para armazenar o seu código genético. O DNA contém a informação que as células usam para fazer proteínas. É formado a partir de dois filamentos que se unem formando um estrutura em forma de hélice.
Enzima – Uma enzima é uma proteína que acelera as reações químicas por meio da adaptação ou alteração de outras proteínas e moléculas.
Fluorescência – Esta é a luz emitida por certas moléculas quando elas absorvem energia.
Imunidade de rebanho – Este método de proteção contra a propagação de doenças proporciona imunidade populacional por meio da vacinação de uma grande porcentagem da população, protegendo assim aqueles que não são imunes pela redução das suas chances de exposição à doença.
RNA – Ácido Ribonucleico – Em humanos, o RNA tem muitas funções, mas uma das principais é copiar sequências do DNA para fazer proteínas. Alguns vírus utilizam o RNA ao invés do DNA para armazenar seu código genético, incluindo o vírus que causa a COVID-19.
Sensibilidade – A capacidade de um teste diagnóstico ter um resultado positivo quando se espera que seja positivo.
Soro – O soro é um líquido amarelado que faz parte do sangue. É o componente líquido do sangue uma vez removidas as células sanguíneas.
Especificidade – A capacidade de um teste diagnóstico ter um resultado negativo quando se espera que seja negativo.
Swab – Um pequeno pedaço de gaze ou outro material absorvente preso a uma haste utilizado para a coleta de amostras de pacientes. Tanto os swabs longos como os curtos são utilizados em testes de coronavírus. Os swabs longos são utilizados por um clínico para a coleta de esfregaços nasais, mas os curtos podem ser utilizados pelos próprios pacientes. Diferentes protocolos podem requerer diferentes tipos de swab.
Reação em Cadeia da Polimerase via Transcriptase Reversa (RT-PCR)
Visão geral da tecnologia
PCR é uma técnica científica muito comum que tem sido amplamente utilizada em pesquisa e medicina por cerca de 20 a 30 anos para detectar informações genéticas. RT-PCR é uma versão especial usada para detectar o RNA e agora está sendo usada como teste para detectar o SARS-CoV-2, o vírus causador da COVID-19. Este tipo de teste tem sido frequentemente utilizado como teste de linha de frente para a COVID-19, pois testa diretamente a presença do RNA do vírus.
Os testes de RT-PCR são bastante rápidos, sensíveis e confiáveis, capazes de gerar resultados em 3 a 4 horas, embora isso normalmente leve mais tempo se as amostras tiverem que ser enviadas primeiramente para laboratórios externos especializados (6 a 8 horas, em média).
Muitas empresas de diagnóstico e pesquisa fabricam produtos, testes e aparelhos de RT-PCR, portanto, a tecnologia está amplamente disponível. Alguns testes de RT-PCR são desenvolvidos como um kit “tudo-em-um”, reduzindo o manuseio do laboratório e o potencial de contaminação.
Como ela funciona
Uma vez coletada uma amostra, são utilizados produtos químicos para remover quaisquer proteínas, gorduras e outras moléculas, deixando apenas RNA para trás. Isto será uma mistura do material genético de uma pessoa, bem como qualquer RNA viral que possa estar presente.
As enzimas do kit do teste copiam o RNA para o DNA, que é amplificado para permitir a detecção de vírus usando uma máquina de PCR que faz o ciclo de temperatura do teste para que cerca de 35 bilhões de cópias de DNA viral sejam feitas para cada filamento de RNA viral que estava originalmente presente.
Marcadores fluorescentes são normalmente usados para se ligar ao DNA amplificado e produzir luz, que pode ser lida pela máquina para produzir o resultado do teste. Se a intensidade da luz produzida dentro da amostra atingir um determinado limiar, este é classificado como um teste positivo. O número de ciclos de temperatura de PCR que foram necessários antes que o limiar de fluorescência fosse atingido é registrado e dá uma estimativa da quantidade de vírus que estava presente na amostra do paciente.
- O DNA viral é aquecido até 95ºC, separando os seus dois filamentos.
- A reação é resfriada até 55ºC, o que faz com que os filamentos separados se liguem a filamentos de DNA pequenos e complentares e também a marcadores fluorescentes.
- Aquecendo a reação até 73ºC permite que os novos filamentos de DNA se liguem e se expandam, produzindo 2x a quantidade de DNA em comparação com a quantidade produzida no passo 1.
- Os ciclos de aquecimento e resfriamento (passos 1-3) são repetidos aproximadamente 30 vezes, e a cada vez a quantidade de DNA viral formado dobra. Isto pode então ser detectado pela máquina.
O que o teste detecta?
O RT-PCR detecta se o RNA viral está ou não presente em amostras de um paciente. Ele faz isso capturando e amplificando regiões do material genético do vírus, geralmente a proteína Spike, a proteína N ou o Envelope (veja a figura).
Para medir o RNA viral, ele é convertido em DNA, copiado muitas vezes usando ciclos repetidos de temperatura em uma máquina de PCR e depois são usados marcadores fluorescentes para detectar o vírus. Se a quantidade de fluorescência ultrapassar um certo nível, isto confirma que o vírus está presente. O número de ciclos de temperatura que a máquina realiza para atingir este limiar é registrado para estimar a quantidade de vírus presente na amostra do paciente. Quanto menor o número de ciclos, mais vírus estava presente. Geralmente estas amostras são retiradas do nariz ou da garganta usando swabs longos ou curtos, mas as amostras também podem ser coletadas de outras formas. A coleta de amostras de onde o vírus está se espalhando ou se multiplicando melhora a acurácia do teste.
Diagrama do virús extraído de:
O que significa o resultado?
Um teste RT-PCR é altamente sensível e bastante confiável se realizado em uma amostra de uma parte infectada do corpo enquanto uma infecção ativa está ocorrendo.
Resultado do teste positivo: – Um resultado positivo de PCR significa que a pessoa da qual a amostra foi retirada está atualmente infectada pelo vírus.
Resultado do teste negativo: – Um resultado negativo de PCR pode significar que a pessoa não está atualmente infectada por este vírus, o vírus não está presente no local de onde a amostra foi retirada, a amostra retirada foi de qualidade ruim, ou que a infecção está em um estágio muito precoce, ou muito tardio, para detectar a replicação do vírus. É por isso que resultados negativos de testes exigem que novas amostras de pacientes sejam coletadas alguns dias depois para reduzir a chance de, incorretamente, deixar de identificar uma pessoa infectada.
O teste RT-PCR não pode detectar se uma pessoa teve o vírus e então o eliminou após o fim da doença COVID-19, ou seja, se uma pessoa teve a doença, pois ele só detecta quando o vírus ativo está presente.
Vantagens e limitações
Vantagens:
- O RT-PCR é aceito pelos cientistas e pela equipe médica como uma técnica robusta e bem documentada.
- Como o RT-PCR é muito comum em pesquisa e medicina, a tecnologia já está em uso para testar para a COVID-19.
- O RT-PCR pode detectar infecções atuais de doenças, permitindo que a equipe médica determine quem está atualmente infectado e quem não está.
Desvantagens:
- O RT-PCR depende da captura e detecção do vírus e, portanto, é possível não detectar os pacientes que já se curaram e se recuperaram da doença.
- A distribuição do vírus pelo trato respiratório varia entre os pacientes, portanto, mesmo que uma pessoa esteja infectada, o vírus pode ser detectável apenas na expectoração ou no swab nasofaríngeo, mas não necessariamente nos dois locais ao mesmo tempo.
- O RT-PCR para COVID-19 só pode dizer se uma pessoa está atualmente infectada com este coronavírus em particular. Ele não pode fornecer informações sobre outras doenças ou sintomas.
Mais informações
Veja os links abaixo para mais informações sobre o RT-PCR.
Resumo básico do RT-PCR (breve apresentaçao de vídeo):
https://www.youtube.com/watch?v=EaGH1eKfvC0
Princípios científicos do RT-PCR (vídeo de 20 minutos dos princípios da RT-PCR):
https://www.youtube.com/watch?v=DH7o9Df5_50
Como o coronavírus é detectado pelo RT-PCR (pequeno artigo sobre testes de COVID-19 via RT-PCR):
https://www.iaea.org/newscenter/news/how-is-the-covid-19-virus-detected-using-real-time-rt-pcr
Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP)
Visão geral da tecnologia
A Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (LAMP) é um processo similar ao RT-PCR, mas ao invés de usar uma série de mudanças de temperatura para produzir cópias do DNA viral, o LAMP é conduzido a uma temperatura constante de 60-65°C.
A quantidade de DNA produzida no LAMP é muito maior do que na RT-PCR e um resultado positivo do teste pode ser visto visualmente sem a necessidade de uma máquina para ler os resultados.
O LAMP é uma técnica mais recente comparada ao RT-PCR, mas é tecnicamente simples e fácil de ser realizada por um cientista treinado, tornando-a uma técnica potencialmente útil para a detecção de COVID-19. Por ser uma tecnologia mais nova, há menos evidências sobre o seu uso, mas as empresas de diagnóstico estão atualmente realizando ensaios clínicos para apoiá-la.
Como ela funciona
Os ensaios LAMP para COVID-19 começam com a coleta de amostras do nariz ou da garganta usando um swab, mas também podem usar amostras coletadas usando outros métodos, como o muco produzido pela tosse intensa.
Assim como RT-PCR, o RNA viral na amostra é convertido em DNA, o que permite que ele seja copiado.
A amplificação do DNA viral usando a tecnologia LAMP e reagentes pode ser detectada quando a mistura de reação se torna turva devido à produção de um produto químico chamado ‘pirofosfato de magnésio’. Como esta turvação pode ser vista a olho nu, ela permite o diagnóstico fácil da COVID-19 por cientistas e clínicos.
A acurácia dos resultados pode ser melhorada com o uso de corantes fluorescentes especiais ou corantes de mudança de cor na mistura de reação.
Como os corantes interagem com o DNA viral, a intensidade da luz ou da mudança de cor pode ser medida para dar o número aproximado de moléculas de RNA viral que estava inicialmente na amostra.
O que o teste detecta?
Assim como o RT-PCR, o LAMP detecta se o RNA viral está ou não presente em amostras de um paciente. Ele faz isso capturando e amplificando regiões do material genético do vírus, geralmente a proteína Spike, proteína N, Envelope ou múltiplas regiões ao mesmo tempo (veja o diagrama do vírus na seção RT-PCR acima).
As amostras podem ser coletadas da mesma forma que são coletadas para RT-PCR, geralmente do nariz ou da garganta usando swabs longos ou curtos, ou através do muco produzido quando uma pessoa tosse fortemente. Para medir o RNA viral, ele deve ser convertido para DNA usando uma enzima e copiado muitas vezes. Os resultados do teste são determinados com base na turvação ou mudança de cor da mistura da reação.
O que significa o resultado?
Como o RT-PCR, os testes LAMP são altamente sensíveis e confiáveis se realizados em uma amostra de uma parte infectada do corpo enquanto uma infecção ativa está ocorrendo.
Resultado do teste positivo: – Um resultado positivo do LAMP significa que a pessoa de quem a amostra foi retirada está infectada pelo vírus no momento.
Resultado do teste negativo: – Um resultado negativo no LAMP pode significar que a pessoa não está infectada por este vírus no momento, que o vírus não está presente no local de onde a amostra foi retirada, ou que a infecção está em um estágio muito precoce, ou muito tardio, para detectar a replicação do vírus. É por isso que quando os resultados dos testes são negativos, novas amostras de pacientes são coletadas alguns dias depois para reduzir a chance de, incorretamente, deixar de identificar uma pessoa infectada.
Os testes LAMP não conseguem detectar se uma pessoa teve o vírus e depois o eliminou após o fim da doença COVID-19, ou seja, se uma pessoa teve a doença, pois eles só detectam quando o vírus ativo está presente.
Vantagens e limitações
Vantagens:
- O LAMP é uma técnica rápida que pode produzir resultados em 2 a 3 horas.
- Os resultados podem ser lidos a olho nu.
- O método simples e barato pode ser feito dentro dos laboratórios hospitalares, melhorando o tempo entre a coleta de uma amostra e a obtenção de um diagnóstico.
- O LAMP pode detectar infecções atuais de doenças, permitindo que a equipe médica determine quem está infectado no momento e quem não está.
Desvantagens:
- A tecnologia é mais nova que o RT-PCR e não tem um histórico tão grande de pesquisas por trás dela. Testes usando a tecnologia LAMP para a COVID-19 ainda estão sendo avaliados em ambientes clínicos.
- A ciência por trás da construção desses testes é mais complexa do que a do RT-PCR.
- Os testes LAMP dependem da captura e detecção do vírus e, portanto, é possível não detectar pacientes que tenham eliminado o vírus e se recuperado da doença.
- A distribuição do vírus varia no trato respiratório entre os pacientes, portanto, mesmo que uma pessoa esteja infectada, o vírus pode ser detectado apenas na expectoração ou no swab nasofaringeo, mas não necessariamente em ambos os locais ao mesmo tempo.
- Os testes LAMP para COVID-19 só podem dizer se uma pessoa está infectada no momento por este coronavírus em particular. Eles não podem fornecer informações sobre outras doenças ou sintomas e não informam à equipe se um paciente foi previamente infectado pelo vírus ou se um paciente tem alguma imunidade ao vírus.
Mais informações
Por favor veja os links abaixo para mais informações sobre os ensaios LAMP
Breve introdução ao LAMP para diagnósticso (vídeo de 8 minutos):
https://www.youtube.com/watch?v=Kc_0Hs_EI2Y
Apresentação de slides com animação do processo LAMP em ação (vídeo de 2 minutos):
https://www.youtube.com/watch?v=ZXq756u1msE
Amplificação Isotérmica Mediada por Loop (artigo de pesquisa científica sobre diagnóstico usando LAMP):
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19396514/
Fluxo lateral / Imunocromatografia ouro coloidal
Visão geral da tecnologia
Os ensaios de fluxo lateral têm sido comumente referidos na mídia como “testes de anticorpos“, uma vez que são usados atualmente para detectar anticorpos para a doença no sangue de um paciente. A tecnologia também está sendo testada para o uso de antígenos.
Os ensaios de fluxo lateral utilizam a mesma tecnologia comumente usada para testes de gravidez. Os testes de fluxo lateral podem detectar anticorpos contra vírus no sangue do paciente indicando que o paciente tem COVID-19 ou se recuperou da COVID-19. Menos comumente, os testes de fluxo lateral podem ser usados para detectar a presença de vírus ativos, detectando diretamente as proteínas virais.
Os testes de fluxo lateral de anticorpos para o SARS-CoV-2 são produzidos como kits de teste usados por um especialista ou clínico e não pelos próprios pacientes. Eles requerem uma gota de sangue do paciente, seja de uma veia ou de uma pequena picada no dedo, semelhante a um teste de espetada no dedo usado para a monitorização do açúcar no sangue em certos tipos de diabetes.
Estes tipos de testes funcionam de forma muito diferente das técnicas de RT-PCR e LAMP e detectam a resposta imunológica de anticorpos do paciente ao vírus, ao invés de detectar o vírus em si.
Os testes de anticorpos de fluxo lateral podem ser completados rapidamente e os testes podem ser produzidos a baixo custo, por isso várias empresas de diagnóstico estão trabalhando arduamente para desenvolver testes de fluxo lateral para o SARS-CoV-2.
Uma grande vantagem deste tipo de teste é também a capacidade de ver se os pacientes estão infectados no momento ou se se recuperaram da COVID-19, mesmo que tenham se recuperado totalmente e eliminado o vírus meses atrás. No entanto, ele não pode distinguir entre uma infecção ativa e uma infecção prévia.
Como funciona
Os imunoensaios de fluxo lateral para COVID-19 são dispositivos simples que podem detectar anticorpos no sangue. Uma pequena amostra de sangue do paciente é retirada de uma veia ou de uma picada em um dedo por um clínico e colocada em uma esponja dentro do dispositivo de teste. Algumas gotas de um líquido diluidor chamado “tampão” são adicionadas para ajudar a amostra de sangue a fluir através do dispositivo.
À medida que a amostra se move ao longo do dispositivo, os anticorpos contra o SARS-CoV-2 que estão presentes na amostra se fixarão aos elementos químicos do dispositivo, capturando os anticorpos nas linhas de teste e controle. Este processo de captura e ligação resulta em uma mudança de cor ao longo das linhas de teste e controle que podem ser vistas a olho nu, produzindo uma, duas ou três linhas dependendo do tipo de anticorpos presentes (IgM ou IgG).
- Amostra de sangue e tampões são colocados no dispositivos
- À medida que a amostra se move ao longo do dispositivo, ela atinge as linhas do teste
- Isso permite que a amostra se ligue as linhas de teste ou controle contendo anticorpos, e esta ligação resulta em uma mudança de cor caso o anticorpo correta seja detectado.
What does the test detect?
O que o teste detecta?
Lateral flow immunoassays for SARS-CoV-2 detect two types of protective antibodies that are produced by the body when the immune system recognises a foreign structure, in this case SARS-CoV-2, the virus causing COVID-19.
Os imunoensaios de fluxo lateral para o SARS-CoV-2 detectam dois tipos de anticorpos protetores que são produzidos pelo organismo quando o sistema imunológico reconhece uma estrutura estranha, neste caso o SARS-CoV-2, o vírus causador da COVID-19.
Estes anticorpos ajudam a combater a doença e permanecem no sangue durante meses após o vírus e a doença serem eliminados. A presença de anticorpos no corpo é frequentemente referida como imunidade ou que uma pessoa é imune a um vírus, pois estes anticorpos protegem contra a reinfecção e o retorno da mesma doença.
Quando somos infectados por vírus, nosso sistema imunológico produz anticorpos do tipo “protótipo” precoce (IgM) com força intermediária de ligação ao vírus, que são capazes de começar a trabalhar para eliminar o vírus cerca de 5 dias após uma nova infecção. Normalmente, 8 a 10 dias após a infecção, os anticorpos IgG com alta força de ligação, podem agir para ajudar na eliminação mais rápida do vírus. Os anticorpos atuam desenvolvendo uma superfície de contorno compatível para aderir a antígenos estranhos, usando um sofisticado processo de seleção para amplificar os anticorpos com a melhor superfície compatível e a ligação mais forte.
Os imunoensaios de fluxo lateral de anticorpos podem ser projetados para detectar IgM ou IgG sozinhos ou ambos juntos.
Os imunoensaios de fluxo lateral de antígenos são uma tecnologia ainda mais nova com desafios científicos e técnicos adicionais, o que significa que não é provável que eles sejam desenvolvidos durante o período pandêmico. Estes ensaios de antígenos detectam o vírus diretamente sem as etapas de amplificação de RT-PCR e LAMP e, assim como estes testes, só são capazes de detectar infecção viral ativa atual, mas não infecção passada.
O que significa o resultado?
Os imunoensaios de fluxo lateral de anticorpos detectam anticorpos para o vírus no sangue. Eles não detectam o vírus em si. A capacidade de detectar a resposta do sistema imunológico de forma confiável usando apenas uma amostra (sangue) é uma grande vantagem, assim como a amplificação do sinal de detecção gerado pela resposta imunológica do corpo. Usar apenas a resposta do anticorpo não permite distinção entre indivíduos que estão infectados atualmente e aqueles que eliminaram a infecção pelo vírus.
Os testes de anticorpos possuem uma habilidade extremamente importante para detectar infecções passadas do vírus e assim identificar pessoas que estavam assintomáticas, pessoas que eliminaram o vírus e assim não correm mais o risco de serem infectadas ou espalhar o vírus para outras pessoas. Além disso, os testes de anticorpos são importantes para avaliar a propagação do vírus na população e o nível de imunidade de “rebanho” na população. Isto é importante para entender as possíveis consequências do relaxamento ou reforço de medidas para controlar o vírus, como quarentena, distanciamento social, fechamento de escolas e locais de trabalho.
Os testes de imunoensaio de fluxo lateral de anticorpos IgG e IgM são muito simples de le. Uma linha de controle deve aparecer para mostrar que o ensaio funcionou corretamente. Então, linhas de teste aparecerão se um dos tipos de anticorpos for encontrado na amostra. O aparecimento de linhas para IgG ou IgM, ou ambos indicam um teste positivo – mostrando que o paciente foi infectado com o coronavírus COVID-19.
Vantagens e limitações
Vantagens:
- Os ensaios de fluxo lateral são extremamente rápidos por paciente, com resultados em apenas 15 minutos.
- Testar os níveis de anticorpos no sangue permite que uma única amostra, de um paciente, de uma parte acessível do corpo onde a amostragem é não invasiva, seja testada para detectar a presença de vírus.
- Estes testes requerem muito pouco treinamento para serem realizados e não dependem de laboratórios especializados ou cientistas para a análise.
Desvantagens:
- A tecnologia é nova e a evidência de sua acurácia no diagnóstico do coronavírus ainda está sendo avaliada.
- Até o momento, os testes de fluxo lateral disponíveis só podem determinar se um paciente foi infectado pela COVID-19 em algum momento. Outros testes seriam necessários para verificar se um paciente está infectado no momento. Versões futuras desta tecnologia podem permitir que os clínicos detectem infecções atuais.
- Os testes de fluxo lateral são mais caros e demorados para testes com grandes lotes do que testes de anticorpos baseados em laboratórios especializados, como o ELISA.
Mais informações
Por favor veja os links abaixo para mais informações sobre a tecnologia de fluxo lateral.
Resumo básico dos imunoensaios de Fluxo Lateral (animação curta de 2 minutos):
https://www.abingdonhealth.com/videos/how-does-a-lateral-flow-immunoassay-work/
Como o coronavírus é detectado por RT-PCR e fluxo lateral (breve artigo de FAQ sobre testes COVID-19 por RT-PCR e fluxo lateral):
https://www.bivda.org.uk/News-Events/Blog/ArticleID/270/A-short-FAQ-on-COVID-19-Testing
Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
Visão geral da tecnologia
Um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) é uma técnica bioquímica comum que pode ser utilizada para detectar antígenos ou anticorpos, dependendo do tipo de teste utilizado.
Os testes de ELISA usam enzimas ligadas a anticorpos que podem se fixar à molécula que está sendo testada e causar uma mudança de cor que pode ser medida por uma máquina especializada. A força da mudança de cor dá aos cientistas e clínicos uma idéia do número de moléculas de interesse na amostra.
O testes de ELISA podem ser feitos como lotes padronizados de até 96 testes completados ao mesmo tempo, permitindo um método barato e efetivo para grandes números de amostras de pacientes ao mesmo tempo. Esta tecnologia pode ajudar a acelerar o número de doentes que podem ser testados para o SARS-CoV-2. Os ensaios ELISA mais efetivos na monitorização de infecções prévias detectam anticorpos contra o SARS-CoV-2. O futuro teste de ELISA poderia ser usado para testar a infecção ativa pelo vírus por meio da detecção da proteína do vírus (antígeno), mas este teste não será tão acurado e ainda não foi comprovado.
Como ela funciona
Um ensaio de ELISA detecta anticorpos produzidos no sangue do paciente devido à infecção com o SARS-CoV-2. O teste completo pode ser realizado em um tubo ou reservatório e envolve a mistura de amostras do paciente, anticorpos, antígenos e enzimas em conjunto com uma molécula que muda de cor. O exemplo abaixo descreve um teste ELISA típico de anticorpos.
- Uma amostra de sangue ou soro de um paciente (que pode conter anticorpos para SARS-CoV-2) é adicionada a um poço contendo o antígeno específico SARS-CoV-2.
- Os anticorpos do paciente para SARS-CoV-2 se aderem às proteínas do SARS-CoV-2 revestidas no fundo do poço e o resto da amostra líquida é lavado.
- Outros anticorpos conjugados a enzimas produzidos em laboratórios são adicionados e se fixam aos anticorpos do paciente presentes no poço como uma “segunda camada”. O excesso de anticorpos conjugados a enzimas é lavado, então as enzimas só estão presentes nos poços quando um paciente produziu anticorpos contra a COVID-19.
- Uma molécula especial transparente é adicionada ao poço.
- Em poços contendo amostras de pacientes que foram infectados com COVID-19 e portanto têm anticorpos contra o vírus, a “segunda camada” de anticorpos conjugados a enzimas agem na molécula especial transparente fazendo com que ela mude de cor rapidamente indicando um teste positivo.
- Essa mudançça de cor pode ser lida a olho nu ou através de uma máquina chamada espectofotômetro.
- Se o paciente não tiver sido infectado com a COVID-19, o anticorpo conjugado à enzima não vai se fixar a nada no poço e a molécula transparente não vai mudar de cor. Este seria um teste negativo.
O que o teste detecta?
Os testes ELISA para detectar anticorpos estão detectando a resposta dos anticorpos à infecção por COVID-19.
A detecção de anticorpos para SARS-CoV-2 pode dizer a um clínico se um paciente foi infectado com a COVID-19, seja no momento ou no passado. No entanto, os pacientes infectados não serão detectados imediatamente após a infecção, mas apenas quando o sistema imunológico para o vírus puder ser detectado no sangue, cerca de 5 dias após a infecção para um teste de detecção de anticorpos IgM, que é mais ou menos o mesmo tempo em que os sintomas ocorrem. O conhecimento atual sugere que uma vez que uma pessoa tenha sido infectada pelo vírus, seu sistema imunológico irá prevenir uma infecção futura com o mesmo vírus.
Este teste ELISA de anticorpos fornece informações muito importantes para diagnóstico, manejo e recuperação da COVID-19 e também ajudará os pesquisadores a avaliar quantas pessoas da população foram infectadas, o que é importante para o planejamento do controle da infecção.
O que significa o resultado?
Um teste de anticorpos usando ELISA mostraria um resultado positivo (mudança de cor) se o paciente tivesse anticorpos para COVID-19. Isto pode significar que ele não tem o vírus no momento, apenas que já o teve em algum momento. Isto porque os anticorpos permanecem no sangue mesmo depois que a infecção desaparece para ajudar a dar imunidade ao corpo se eles entrarem em contato com o vírus novamente. Um resultado negativo (sem mudança de cor) significaria que o paciente não foi infectado pela COVID-19 e pode não ter imunidade contra ele.
Os testes ELISA de antígenos podem ser desenvolvidos no futuro para detectar infecções atuais. Tal teste de antígeno usando ELISA mostraria um resultado positivo (mudança de cor) se o paciente tivesse COVID-19 em seu sangue. Isto indicaria que o paciente está infectado no momento com a COVID-19. Um resultado negativo (sem mudança de cor) indicaria que nenhum antígeno COVID-19 foi encontrado na amostra do paciente. Isto pode significar que o paciente não tem COVID-19, mas também pode significar que os anticorpos estão em um um estágio muito precoce da infecção para serem positivos. Se o paciente tiver sintomas de COVID-19, ele deve ser testado novamente alguns dias depois para ter certeza.
Vantagens e limitações
Vantagens:
- ELISA é uma técnica de laboratório simples e barata.
- ELISA é bem estabelecido e documentado na ciência e na medicina.
- Os resultados normalmente podem ser produzidos em 1 a 3 horas após a coleta de uma amostra do paciente.
- Por ser tão rápido de realizar pode ser feito em um laboratório hospitalar, diminuindo o tempo para o diagnóstico.
- O teste ELISA pode ser realizado em várias amostras ao mesmo tempo, de modo que pode ser usado para testes rápidos escalonados para testar um número maior de pacientes.
Desvantagens:
- Os testes ELISA ainda não estão bem estabelecidos para a testagem do SARS-CoV-2 da COVID-19, embora muitas empresas estejam trabalhando arduamente para produzi-los e testá-los nos pacientes.
Mais informações
Por favor veja os links abaixo para mais informações sobre a tecnologia ELISA.
A Wikipedia tem um bom resumo dos principais tipos de ELISA disponíveis (link Wikipedia):
https://en.wikipedia.org/wiki/ELISA
Resumo científico em vídeo do ELISA (vídeo de 2 minutos):
https://www.youtube.com/watch?v=70TPrfL_8-M
Breve artigo científico sobre testes de coronavírus, mencionando os testes ELISA:
CONCLUSÕES
- Quatro tipos principais de testes estão sendo utilizados ou desenvolvidos para testar o SARS-CoV-2, o vírus causador da COVID-19.
- Estes testes estão em diferentes estágios de desenvolvimento, validação e produção.
- Cada tipo de teste tem suas próprias vantagens e desvantagens inerentes à tecnologia subjacente.
- Uma combinação de tipos de testes usados em diferentes momentos pode ser útil para o manejo do paciente e controle populacional da pandemia da COVID-19.
Enquanto os testes individuais diferem em suas propriedades, geralmente os tipos de teste listados neste documento têm os seguintes perfis:
| Tecnologia | Molécula testada | Laboratório ou local de atendimento (point of care) | Tempo até o resultado | Local típico da amostra | Número típico de amostras testadas por lote |
| RT-PCR | RNA viral | Em laboratório | 3-4 h | Swab nasofaríngeo, expectoração, fezes | Até 96 amostras (laboratório) |
| LAMP | RNA viral | Em laboratório ou local de atendimento (point of care) | 2-3 h | Swab nasofaríngeo, expectoração, fezes | até 96 amostras ou 1-4 amostras no point-of-care |
| Fluxo lateral | Anticorpo (menos comumente antígeno) | Local de atendimento (point of care) | 15-20 min | Sangue para testagem de anticorpos | um amostra de um paciente |
| ELISA | Anticorpo (menos comumente antígeno) | Em laboratório | 1-3 h | Sangue para testagem de anticorpos | Até 96 amostras |
Fim.
Aviso: o artigo não foi revisado por pares; ele não deve substituir o julgamento clínico individual e as fontes citadas devem ser verificadas. As opiniões expressas neste comentário representam as opiniões dos autores e não necessariamente as da instituição anfitriã, do NHS, do NIHR, ou do Departamento de Saúde e Assistência Social. Os pontos de vista não são um substituto para o aconselhamento médico profissional.